第一章文献综述

1.1 研究进展

基因组DNA长约6Kb,具有22个内含子，802个氨基酸，编码蛋白89kD，等电点为5.5。RHD3蛋白N端GTPase区具有两个保守的结构域（GXXXXGKS、DXXG) [i]，具有GTPase活性[5]。与酵母及动物中的a/to幼_? (ATI)基因序列具有同源性，都是GTPase类蛋白[6]。已有研究证明，酵母Seylp及动物ATL蛋白与内质网（Endoplasmicreticulum, ER)功能相关[7]。Zheng发现植物中RHD3在ER与高尔基体（Golgi apparatus )运输中具有重要作用[81。随后Chen发现RHD3蛋白介导拟南芥根及叶表皮细胞中管状ER网络结构的形成以及高尔基体潴泡的分布和运动[9]。

研究发现拟南芥整株植株中表达，发育的胚也有表达，表明可能参与基本的细胞生长及发育过程。RHD3的第一个外显子及第一个内含子，对基因的表达具有重要调控作用。若缺失这一段序列，RHD3仅在根部维管组织及子叶维管组织中不连续的表达。除此之外，第一个内含子的位置也至关重要，只有在顺序为5’端非编码区、第一个外显子、第一个内含子时才会最大程度的启动该基因的表达[2]。

1.2花青素的合成与调控

花青素的合成源自合成黄酮类物质的一个分支。拟南芥合成花青素时，控制花青素合成的酶在ER上松散的形成多酶复合体，花青素在ER朝向细胞质的一面合成，并在液泡中积累[14]。花青素的生物合成受到两类基因调控，如图1.3所示[15]。一类是较早合成基因（EBGs)，另一类是后期合成基因（LBGs)。EBGs是指那些参与黄酮类物质合成的基因群体，主要包括查尔酮合成酶CCHS)，查尔酮异构酶(cm,黄烧酮-3-经化酶(F3ID和类黄酮3，5-轻化酶(F3’H)，这些基因的表达受一个亮氨酸锌指结构转录因子HY5的正调控。LBGs主要包括花青素苷还原酶基因(ANR)以及UDPG (UDP-glucose)：黄酮-3-0-糖基转移酶CUFSGT)[15]。这些基因的表达受到WD40、bHLH、MYB类转录因子复合体的正调控和负调控作用。还有研究表明，转录水平上，EBGs以及LBGs会被R2R3-MYBs激活表达，例如：PRODUCTION OF ANTHOCYAMN PIGMENTl (PAPl )和 PAP2。R2R3-MYBs 会与TRANSPARENT TESTA GLABRAl ( TTGl，一 个 WD40 蛋白）以及一些基本的HELIX-LOOP-HELIX (bHLH)蛋白，例如TT8、GL3、EGL3等形成转录复合体。MYB-bHLH-TTGl转录复合体在时空上调控花青素的合成。不依赖TTG1的的MYB11，MYB12、MYB111以及PAP1同源结构域MYB113、MYB114分别具有调节EBGs、LBGs的功能[16]。 

.........

第二章RHD3 在低氮诱导花青素积累中的作用

2.1材料

大肠杆菌(^Escheichia coli) DH5a、农杆菌 CAgrobacterium tumefacims) GV3101 为本实验室保存，克隆载体pEASY系列购自北京全式金公司、表达载体pORE R1购自拟南芥生物资源中心Biological Resource Center，Ohio State University, USA)。酵母菌 Y2HGold、Y187、质粒pGBKT7、pGADT7为内蒙古大学生命科学学院邢万金教授馈赠。

Primer Star DNA 聚合酶、ExTaq、T4 DNA Ligase、DNaseI、PriineScript? II 1st Strand cDNASynthesis Kit、定量PCR试剂购自大连Takara公司，限制性内切酵购自美国Fermentas公司，植物基因组DNA提取试剂盒、回收试剂盒、质粒提取试剂盒，TRIzol购自北京全式金公司，其余试剂购自Sigma公司。酵母双杂交试剂购自大连Takara公司：DO Supplement-Trp、DOSupplement-Leu、DO Supplement-Leu/~Trp、DO Supplement-Ade/—His/-Leu/—Tip、X-alpha-Gal、Aureobasidin A、Yeastmaker? Yeast Transformation System 2、Minimal SD Base。

2.2方法

在筛选拟南芥突变体时，发现一株植株主根短、根毛短小弯曲且生长受抑制。编号为K84(Col背景）。繁至M3代，未出现表型分离现象，突变体K84为纯合突变体。为研究KL84的表型是否为单基因突变所致，将K84与Col杂交，分析F2代植株表型。选用1/2 MS培养基，播种纯合的K84突变体和Col种子，春化3d，光照培养至植物长有4片真叶，移入土中，继续生长。(1)以K84为母本，Col为父本进行杂交。(2)收获杂交角果，即得F1代种子，干燥7d。

第二章RHD3 (ROOT HAIR DEFECT IVE3)在低氮诱导花青素积累中的作用....... 29

2.1 材料 ........ 29

2.1.1实验材料 ...............29

2.1.2菌种与质粒............. 29

2.1. 3主要试剂 .....................29

第三章拟南芥转录组响应低Ca引起的细胞质Ca2+浓度（[Ga2+]升高分析.................. 72

3. 1 材料................. 72

3.1.1实验材料..................... 72

3.1.2主要试剂和试剂盒 ...........................72

结论与讨论.....................89

第三章拟南芥转录组响应低Ca弓丨起的细胞质Ca2+浓度（[Ca2+]cyt)升高分析

3.1材料

Agilent拟南芥4X44K表达谱芯片，购自上海国家基因芯片工程中心；TransZol UP购自北京全式金公司；ExTaq聚合酶（DRROOIA)、DNase I、感受态细胞提取试剂盒（D406)、反转录试剂盒（D6210S)、定量PCR检测试剂SYBR Premix Ex Taq II (DRR081A)购自大连宝生物工程有限公司；1，3-双[(三轻甲基)甲基氨基]丙焼(BTP)、1,2-双（2-氣基苯氧基）乙烧-N，N，N，N-四乙酸四钠（BAPTANa4)、腔肠荣光素（Coelenterazine，CTZ)、GdCb、NPS2390、AP-5、DNQX、阿服（Alloxan)、新霄素（Neomycin)、Thapsigargin、其他化学试剂均购自Sigma公司。

3.2实验方法

(1)向12孔板各孔中加入3 ml CK液体培养基，每孔放入4株在CK固体培养基光照培养10 d的植物，平衡24h;(2)镊子小心取出植株，放入灭菌ddlfcO中漂洗3次；(3)漂洗结束后，吸水纸吸干植株表面ddlfcO;(4)向一个新12孔板中加入3 ml CK液体培养基（CK组)，另一板加入3 ml无Ca液体培养基（低Ca组)，将漂洗后的植株分别放入装有CK及无Ca液体培养基的12孔板中，处理24h，CK及低Ca组各一板植物。每周重复一次，进行三次生物学重复，用于芯片分析。(5)用镊子小心汇聚12孔板各孔植物，吸水纸吸干，放入液氮速冻，-80°C保存备用。CK及低Ca组分别收集植物材料，防止交叉污染。

.............

结论与讨论

Ca是所有生命体进行生命活动所必需。但酸雨频降导致土壤中的Ca含量显著下降，这威胁着生态系统健康有序的发展。植物细胞中Ca作为必需的第二信使在植物应对光、温、水、气、热等非生物环境胁迫作用已经研究的比较透彻，但应对低Ca环境所产生的细胞学反应及转录组变化并不清楚。动物细胞在感知胞外Ca浓度变化时具有复杂的调节机制，细胞质膜上的受体可以感知第一信使[Ca2+;U变化，并起始其依赖的[Ca2+]eyt信号转导途径。本文研究拟南芥感知胞外低Ca时[Ca2+]。yt及转录组变化，发现植物细胞同动物细胞一样，具有相似的感知细胞外低Ca的机制。当细胞处于外界低Ca时会诱导胞质内一系列编码Ca感知蛋白基因的表达，这也说明[Ca2+]。yt在感知[Ca2+;U变化时具有作用。当外界环境中Ca降低时会显著诱导[Ca2+]eyt升高就是一个证据，如图3.1所示。在以烟草悬浮细胞系为实验材料，向细胞平衡液中加入EGTA以螯合Ca2+，也会激发瞬时的[Ca2+]eyt升高[24]。在海马神经中，降低的[Ca2+;Ut会导致细胞去极化，并激活 TRPM7 ( TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL CATION CHANNELSUBFAMILYM MEMBER?)阳离子通道[3o]。本研究中，Gd3+是一个细胞质膜Ca通道抑制剂，显著抑制由细胞外低Ca引起的[Ca2+]cyt升高反应,这意味着细胞外Ca2+内流是[Ca2+]eyt升高的一个来源。植物细胞中，增加胞外K+浓度会使细胞去极化[31]，本研究中，当细胞去极化后，显著抑制低Ca导致的[Ca2+]eyt升高现象。有研究表明增加IP3的量可以促进海马TRPM-7介导的阳离子电流[3^。在本文中抑制了 IP3的合成则显著抑制低Ca导致的[Ca2+]eyt升高。这些实验结果说明动物细胞与植物细胞在感知胞外低Ca诱导的[Ca2+]eyt升高机制上具有相似性。

............

参考文献（略）