第 1 章 绪 论

1.1 胃癌的相关背景

胃癌（carcinoma of stomach）在我国是最常见的恶性肿瘤之一，胃癌的死亡率高居各类恶性肿瘤的第二位。目前被临床和病理学界所广泛接受的观点认为，胃癌起源于胃壁内最表层的胃壁组织粘膜上皮细胞中，它常常可以侵犯胃壁不同的广度和深度，临床观察发现胃癌可发生于胃的任何部位，流行病学研究发现，胃窦幽门区胃癌出现的最多，胃癌在胃底贲门区发生较多，而在胃体部胃癌的发生比较少[1]。早期胃癌是指癌灶单单侵犯了胃部粘膜内组织或者粘膜下层的组织, 而进展期胃癌是指癌灶已经侵及肌层组织深度，或者胃癌癌灶已经转移到胃部以外其他区域。实际上胃癌有多种的形态和分类，最常见的有溃疡型、浸润型、表浅型、肿块型、溃疡癌（也有观点认为这属于慢性胃溃疡癌变）。从组织学角度，通过显微镜观察到胃癌组织的不同形态，可以将其分为腺鳞癌、鳞状细胞癌、未分化癌、腺癌（占约 90%,包括管状腺癌、粘液腺癌、乳头状腺癌、印戒细胞癌）以及类癌等。即便显微镜下的组织学形态是一致的，胃癌细胞内部更细微的分子结构也有很多的不同，按照这种分法，还有很多独特的胃癌种类等待研究者们去发现。

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1.2 蛋白质糖基化结构及其功能的综述

目前人类基因组计划全部测序已经初步完成，对于基因组学研究重点已经转到对基因功能的研究上。特定蛋白质的翻译后特殊修饰的结构特点及功能的研究对于揭示各种各样蛋白的生物学功能具有十分重要的生物学作用和生物学意义。蛋白质作为基因功能的主要体现者，对蛋白质表达模式和功能的研究成为目前研究学界的热点，出现了蛋白质组学。国际上蛋白质组学指的是在人类基因组计划研究的基础上形成的一类新兴交叉学科。随着分子生物学、糖组织学特别是蛋白质组学技术的不断推进和发展，对特定蛋白糖基化研究也越来越受到研究者们广泛的关注。目前人类基因组草图已经正式完成并发表[27, 28]，蛋白组学是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、结构及其自身特有活动规律的一门学科[29]。蛋白质翻译后修饰是蛋白质组学的一个组成部分，而蛋白质糖基化是生命体中最重要的一种蛋白质翻译后修饰之一。蛋白质组学（Proteomics）是作为功能基因组学的重要支柱，并已同基因组学和生物信息学一起成为新世纪生命科学研究的前沿和热门领域[30, 31]。蛋白质的翻译后修饰（post-translation modifications, PTMs）研究，如：磷酸化，二硫键，乙酰化或糖基化等研究就是是蛋白质组学研究中的极其重要的内容[32]。关于蛋白质糖基化修饰方面的研究，目前已经成为科学界，特别是生命科学界研究的热点，蛋白质糖基化的研究内容主要包括以下几个部分。首先是对糖蛋白进行鉴定，也就是说，要确定糖蛋白的存在；其次是对糖蛋白的富集，也就是对糖蛋白进行分离和纯化。对于糖蛋白的鉴定，是蛋白质糖基化研究的重点和难点。糖蛋白研究，主要包括了两个问题：第一就是糖基化氨基酸位点的鉴定，目前这也是研究热点；第二就是确定糖蛋白中糖组成的确定和糖蛋白含量的测定。

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第 2 章 凝集素芯片技术在鉴别胃癌与溃疡的应用研究

2.1 实验材料

20 份胃癌病人癌变组织样本及 20 份胃溃疡病人癌变组织（用于提取糖蛋白）样本由 2010 年 1 月至 2013 年 1 月北华大学附属医院内镜中心及普外科提供；22 例腺癌、9例印戒细胞癌、7 例未分化癌、5 例类癌、10 例淋巴转移癌、5 例原位癌、9 例胃溃疡组织（免疫组化染色）组织样本由 2010 年 1 月至 2013 年 1 月北华大学附属医院内窥镜中心及普外科提供；组织样本采集前征得患者同意，并签署知情同意书。玻璃片基（76mm×25mm×1mm）购自 Gold Seal 公司；Cy3 荧光染料购自 GE 公司；环氧基硅烷试剂试剂盒（3-glycidyloxypropyl）trimethoxysilane （GPTS）购自 Invitrogen公司；ECA、HHL、WFA 等 37 种凝集素均购自 Vector 公司；BSA、Protease Inhibitor购自 Sigma 公司；T-PER Tissue Protein Extration Reagent 购自 Pierce 公司；其他常用试剂为国产分析纯。

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2.2 实验方法

胃癌病人的癌变组织及胃溃疡组织对照各 20 份，由北华大学附属医院内窥镜中心及普外科提供。将保存于-80℃的组织样本取出，置于一次性培养皿中在室温下解冻，用预冷的 PBS 反复吸打将血块等清除，按 1 g 组织对应 20 mL 的 T-PER 试剂的比例加入试剂，蛋白酶抑制剂按 1 mL T-PER 加 10 μL 的比例加入，将一定量的组织和 T-PER试剂加入到匀浆管中，置于冰上匀浆，研成均质无明显组织块时，吸出加入到 1.5 mL的离心管中，冰上静置 30 min。10000 g，4℃离心 5 min（视情况而定，如若 5 min 后溶液仍混浊，可适当延长离心时间，实验时多用 8-10min），吸取上清至新的离心管中。将 30 μg 的癌变和溃疡组织蛋白（体积总共 100 μL，不够部分由 PBS 补齐）分别与100 μL Na2CO3混匀，吸取混合液用 Cy3 荧光染料标记，室温下避光标记 1-1.5 h，每管各加入 20%羟胺 30 μL，冰上静置 10 min 以终止荧光标记反应，过 G-25 柱分离纯化标记蛋白（荧光标记上的蛋白为红色条带）。加入5 μg组织蛋白（将5份组织蛋白按每份1 μg混在一起），4×杂交液175 μl，1×PBS补足 700 μl，再加入 20%羟胺，在冰浴中放置 30 min-1 h 后覆盖点样区，加盖玻片孵育3 h 孵育结束后用含 0.1% Tween-20 的 10 mM PBS，10 mM PBS 各清洗 2 次，每次 5 min，最后离心甩干芯片。

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第 3 章 讨论及展望.....49

3.1 糖组学的兴起 ......... 49

3.2 糖蛋白概念、组成及分类....... 50

3.3 糖蛋白的研究技术....... 51

3.3.1 凝胶中糖蛋白研究技术 ..... 52

3.3.2 生物质谱技术 ......... 52

3.3.3 凝集素亲合技术 ..... 52

3.4 凝集素及凝集素芯片技术....... 53

3.4.1 凝集素概述 ....... 53

3.4.2 凝集素的应用 ......... 55

3.5 凝集素芯片 ....... 57

3.6 下一步需要解决的问题..... 60

第 4 章 结 论.........63

创新点.....63

第 3 章 讨论及展望

3.1 糖组学的兴起

自从 K.Landsteiner 等研究者 1900 年发现人的血型是不同的，并因此获诺贝尔医学奖之后，免疫学家经过半个世纪的研究于 1960 年由 Watkins 确定了血型抗原决定基的特定糖链结构，表明决定血型的物质是糖链，从此糖链的研究越来越受到人们的重视。20 世纪末提出了糖组学概念，即糖组学是从分析和破解一个生物或一个细胞全部糖链所含特定信息的角度入手，研究糖链的分子结构，表达调整、功能多样性以及糖链与疾病之间关系的新兴学科，从研究对象而言，糖蛋白糖链结构是研究中的极其重要内容。目前美国对糖组学非常重视，而日本在 1991 年开始实施一个耗资数百亿日元的为期 15 年“糖工程前沿计划”，而欧盟 1994 年亦推出了一个“欧洲糖研究开发网络”与美国、日本竞争。国际上已召开了多次糖组学相关的国际会议，糖组学已进入蓬勃发展期。事实上国外关于高通量的实验技术的发展是如此的迅速，以至于各种类型的生物学数据大量涌现。这样海量数据的出现，让我们不得不重新审视“后基因组时代”这个概念。如何存储、处理这些数据，是我们面临的挑战。

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结论

1. 通过凝集素芯片分析发现，胃癌病人癌变组织中糖蛋白的表达种类多于胃溃疡组；

2. 通过凝集素芯片分析发现，癌变组织糖蛋白中的乙酰氨基半乳糖（GalNAc）较胃溃疡组相比明显增加；

3. 通过免疫组化研究进一步证实与 MPL 特异结合的含有 αGalNAc 的糖蛋白，与VVA 特异性结合的含有 GalNAc 和 GalNAcα-Ser/Thr（Tn）的糖蛋白在胃癌组织中均高表达；

4. 与 MPL 及 VVA 特异结合的含有 GalNAc 的糖蛋白主要表达于细胞质，在癌组织中大部分着色为棕黄色和棕褐色，为中度或强染色。

5. 所有类型的胃癌组织均显示了较强的染色，与胃溃疡相比均有显著差异性。凝集素免疫组化结果与凝集素芯片结果一致。

6. 在不同类型的胃癌组织中，与 MPL 特异结合的含有 αGalNAc 的糖蛋白的表达量从高到低依次为：粘膜内癌、印戒细胞癌、腺癌、淋巴转移腺癌、未分化癌、类癌；

7. 在不同类型的胃癌组织中，与 VVA 特异性结合的 GalNAc 和 GalNAcα-Ser/Thr（Tn）的糖蛋白的表达量从高到低依次为：粘膜内癌、印戒细胞癌、类癌、未分化癌、腺癌、淋巴转移腺癌；

8. 凝集素芯片检测糖蛋白技术可为胃癌的早期诊断及治疗提供依据。

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参考文献（略）