本文是博士毕业论文，主要研究小粒径纳米胶束的构建及其在转移性乳腺癌和胰腺癌治疗中的应用。

第一章前言

1.1 NDDS在肿瘤治疗中的研究进展

过去的20年中，粒径在l~1000nm之间的纳米粒己被成功应用于癌症的治疗。纳米技术使在治疗中更加精准的递送药物成为可能，譬如提高药物的溶解度、延长药物半衰期、提高治疗效果以及减少免疫原性得到应用的第一代纳米粒主要是脂质体和聚合物-药物偶联物。脂质体为拥有双层脂质膜结构的球状囊泡，可以包裹亲水性和疏水性药物，保护“货物”（譬如小分子药物、核苷酸、蛋白质、造影剂或者放射标记的核背酸）在体内循环时不被破坏。为了提高脂质体对特定细胞以及组织的紀向性，脂质体可以用细胞表面受体的配体功能化。另外，脂质体表面覆盖聚合物也可以延长循环半衰期。1995年，FDA批准了第一个治疗性脂质体剂型-多柔比星脂质体（Doxil?; OrthoBiotech),治疗HIV引起的Kaposi氏肉瘤，后来又批准用于卵巢癌和多发性骨髓瘤的治疗。多柔比星用脂质体包裹后，半衰期延长，同时在肿瘤组织的蓄积量提高。而且，与游离的多柔比星相比，Doxil?的心脏毒性显著降低【5】。人们对于聚合物-药物偶联物也进行了深入的研究，多个品种得到了批准。由于聚乙二醇（PEG)能够增加药物溶解度，提高药物在血菜中稳定性和减小免疫原性，所以PEG成为聚合物-药物偶联物领域中研究最多的聚合物。1994年PEG-Z<-天门冬氨酸酶（Oncospar; Enzon)成为聚合物-药物偶联物中第一个获得FDA批准的药物，用于淋巴细胞性白血病的治疗[6]。已上市销售的脂质体和聚合物-药物偶联物药物为NDDS研究提供了重要的研究基础，近20年来，两亲性聚合物PM增溶技术得到了世界范围内科学家的关注，广泛应用于药物输送系统。

PM是溶液中自组装形成的具有核壳结构的一种热力学稳定系统，其大小在纳米级范围内，是一个优良的药物载体。其优点如下：1)疏水内核可以装载难溶性药物，大大提高药物的溶解能力； .2)亲水外壳保护胶束内部的药物分子不被外界吸附或降解，此外，合适的外壳能够帮助药物逃逸网状内皮系统的摄取，延长药物循环时间；3)控制药物的释放，优化药物的体内分布以达到更好的治疗效果据统计，目前世界范围内已有40多项纳米治疗技术已经进入了临床研究阶段，Table 1.1为以两亲性聚合物为载体的难溶性药物纳米PM的临床研究概况。两亲性聚合物PM由于自组装形成的特定胶束结构，实现了有别于传统剂型的新型药物递送模式，显著提高药物的治疗效果，成为了人们的研究热点(Tab丨e 1.1 )。纳米粒的第一次合成可以追溯至1950s，时至今日，人们在如何合理设计纳米粒方面已有50多年的经验。构建纳米粒的处方须依照以下原则：生物相容性、免疫毒性以及对于模型药物的溶解和释放能力[24&1。除这三种原则外，人们深入研究了能够实现IE向给药或者改变生物分布的纳米粒。实现範向给药可以利用以下三种策略，其作用模式可称之为被动紀向模式或主动IE向模式。

1.2乳腺癌继发转移灶与胰腺癌的血液低灌注特点

1.2.1乳腺癌继发转移

乳腺癌是女性恶性疾病中最常见的疾病，也是引起死亡的主要原因，仅在2008年，全球范围内就有138万新发确诊病例，有45.84万例死于该病。在美国，乳腺癌的致死率位列第二，每年有40,000名患者死亡，200,000名新发病例出现[34]，患者的5年生存期只有26%。虽然关于乳腺癌治疗方法越来越多样化，但是直到目前为止，其治疗的主要策略仍然以手术、化疗和放疗等传统手段为主。化疗是乳腺癌等上皮细胞恶性肿瘤的首选治疗策略，但效果不明显：5-10%乳腺癌患者化疗无效；50%的乳腺癌患者部分有效；仅有10?20%的乳腺癌患者完全有效。大约90%肿瘤患者死于肿瘤的侵袭和转移转移的形成是肿瘤细胞离开原发灶，沿着身体的血管以及淋巴管在全身寻找新的部位，重新形成细胞克隆，例如，超过80%的肺癌患者都存在转移灶[391。临床数据表明，只有20%肿瘤转移患者生存期超过了 5年。乳腺癌的转移和复发是引起不良预后的最主要原因，也是引起死亡的最重要病因_。2003年美国共发现19，200例侵袭型乳腺癌和46，000例原位乳腺癌，跟踪调查表明，大部分侵袭型乳腺癌患者虽都进行了手术和强势化疗，但生存率基本未见提升，大部分的侵袭型乳腺癌治疗干预基本无意义。在诊断为乳腺癌的30%的患者骨髓中一般有上万个微转移，包括单个癌细胞或者小的肿瘤团块[42]。如果其中的一些微转移在其种植于远处组织几年后发展成临床可辨的转移灶，那么将降低肿瘤患者的长期生存时间。乳腺癌的可怕之处就在于，肿瘤被切除并且宣布患者身上无肿瘤10年乃至20年后的肿瘤再次复发。尽管医疗保健知识逐步提高、普查范围越来越广泛、治疗手段越来越先进，仍有20%-30%的患者复发，5%~7%的患者出现远端转移。

第二章小粒径DTX-PM的构建与表征

2.1引言

在过去的十几年间，两亲性PM已经成为了临床上疏水性治疗药物的增加溶解度的主要选择，mPEG-Z)-PDLLA胶束便是其中之一Grefi72 Bazile 首先分别报道了 mPEG-6-PDLLA 载丨idocaine 和 prednisolone PM，Burt 等报道了mPEG-^?-PDLLA胶束载paditaxel t?!，体内外研究实验[69]表明，mPEG各PDLLA无毒性，且生物相容性良好。韩国Samyang制药在2006年上市了 Genexol-PM?(mPEG-6-PDLLA/paclitaxel),为全世界范围内第一个上市销售的纳米制剂，用于转移性乳腺癌的治疗[11]，后美国FDA批准了 Genexol-PM?的临床试验。而且研究证明，mPEG各PDLLA应用于人体静脉注射途径是安全的载体材料疏水核心的大小与PM粒径范围有很大关系。Cabral等在研究30nm、50nm、70nm、lOOnm 的 PEG-b-P(Glu)/P(Glu)/ DACHPt PM 对于胰腺癌治疗作用的影响时，通过减少疏水链P(Ghi)的掺入比例，成功的制备了不同粒径的PM。因此，选择PDLLA疏水链段的长度较短的mPEG-W>DLLA载体材料，可以得到粒径较小的PM。从DTX与载体材料的生物相容性、载体材料的安全性以及粒径大小三个方面考虑，本文拟初步采用60/40嵌段比例的mPEG2_各PDLLA的作为本课题模型药物DTX的载体材料。

第三章DTX-PM抗乳腺癌转移作用研究........... 33

3.1引言 ...........33

3.2材料、动物和方法........... 33

3.3实验结果与讨论 ...........35

3.3.1细胞增殖抑制实验........... 35

3.3.2 DTX-PM术后化疗药效学讨论........... 38

3.3.3 DTX-PM在早期原位自发转移模型........... 41

3.4小结与讨论 ...........47

第四章TAT-PM的构建以及抗转移作用评价........... 49

4.1引言...........49

4.2材料、动物和方法........... 50

4.3结果与讨论........... 54

4.4小结...........70

第五章主动靶向小粒径胶束的构建、表征........... 71

5.1 引言 ...........71

5.2材料和方法........... 72

5.3结果与讨论........... 75

5.4小结........... 84

5.5小粒径NDDS对转移性乳腺癌治疗机制...........84

结论

本课题的主要研究结论如下：

1)在本文中，我们以mPEG2ooo-WPDLLAi3oo为载体材料、以DTX为模型药物、通过薄膜分散法成功制备得到了粒径为16nm左右的DTX-PM，同时DTX-PM具有较高的载药量和良好的复溶稳定性，具备一定的工业和临床应用价值。我们使用TAT肽、RGD肽和NGR肽修饰DTX-PM的表面，得到了 TAT-PM、RGD-PM和NGR-PM,修饰后的粒径大小也在16nm左右。

2)我们使用4T1小鼠转移性乳腺癌细胞系、能够稳定表达焚光素酶的4Tl?ue小鼠转移性乳腺癌细胞系以及Capan-2iue人胰腺癌细胞系作为药理测试模型，同时成功构建了更加贴近临床治疗实际情况的4T1&4T1 ue乳腺癌原位自发转移动物模型、4Tl&4Tliue乳腺癌术后化疗动物模型和Capan-2iu<=原位移植胰腺癌动物模型。

3)转移性乳腺癌模型实验结果表明，DTX-PM的抗转移作用显著优于现有市售药物多帕菲同时，DTX-PM也优于肿瘤组织渗透性更强的TAT-PM和具备主动IE向作用的NGR-PM、RGD-PM。许多文献报道了小粒径纳米粒具有淋巴富集特点，这提示我们，小粒径PM在治疗转移性乳腺癌中的优势，可能缘于阻断了乳腺癌肿瘤的淋巴播撒途径，这个推测需要进一步的机制研究来证明。

4)胰腺癌模型实验结果表明，小粒径胶束制剂的治疗效果优于市售多帕菲?，表明小粒径胶束在血液低灌注的胰腺癌肿瘤组织中有较高的渗透水平，增加了药物的蓄积量，与我们当初的实验设想一致。

5)表面修饰后的TAT-PM、RGD-PM和NGR-PM对乳腺癌转移和胰腺癌的治疗效果逊于DTX-PM，这可能与三种胶束表面修饰短肽序列后降低了它们的体内稳定性有关，表明了小粒径PM体内稳定性对于治疗效果的重要影响，.我们进而设计了两种小粒径PM，尝试增加DTX-PM的稳定性，结果都不是非常理想，但为以后如何合理设计小粒径NDDS提供了重要的借鉴和参考。

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