本文是博士论文，主要研究组织工程关节软骨再生修复的在体无创监测方法。

第一章 前 言

多种原因引起的关节软骨缺损在临床上十分常见[1-2]，但目前的治疗方法，包括保守治疗和关节清理术、自体或异体骨软骨移植、人工关节置换术等均存在明显缺陷[3-4]。组织工程技术再生修复关节软骨缺损的治疗策略具有良好的应用前景[5-11]。组织工程软骨的三大构成要素中种子细胞是组织修复的执行者。关节软骨组织工程的种子细胞主要包括软骨细胞和干细胞两大类，经体外扩增培养后均可用于构建工程化组织，目前均有成功应用于临床的相关报道[3, 6]。其中，由于骨髓间充质干细胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)具有良好的体外增殖能力及多向分化潜能，被认为是软骨组织工程较为理想的种子细胞[12-15]。但是无论是 BMSCs 还是软骨细胞移植的体内分布、增殖及转归过程，目前尚无安全无创、实时动态的监测手段，因此难以明确外源性种子细胞在关节软骨缺损再生修复中所扮演的角色。迫切需要探索一种对在体在位的移植细胞进行安全、有效、无创追踪和监测方法，以助于组织工程软骨的临床推广。目前动物试验常用的识别植入种子细胞及功能的方法有：基因标记法，如绿色荧光蛋白(GFP)[12-14]；Y 染色体法[17]； 5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷标记法[18]；荧光染料标记法，包括 DAPI、CMDiI、PKH26、PKH67 等[19-20]；同位素标记法[21]等。其中，5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷标记法和荧光染料等标记细胞，标记效率高，但随时间的延长和细胞的分裂增殖，标记物会逐渐衰减消失；基因标记使用的脂质体转染适用于短时间的活细胞示踪，且转染率相对较低。上述方法均只能在离体的情况下，通过组织切片来进行观察，难以实时动态、安全有效地监测移植细胞在活体内的迁徙、分布、增殖等生物学行为，实验效能低，更不适于人体移植细胞示踪研究。

分子影像学技术中的磁标记细胞磁共振成像技术可为工程化组织工程软骨移植修复关节软骨缺损的在体无创监测与临床疗效评价提供一种安全、有效的新方法。根据 MR 对比剂的不同磁标记细胞 MR 示踪方法分为两类：（1）顺磁性 Gd3+对比剂法[22]：MR 成像时主要产生 T1 正性对比效应，因 Gd3+在血循环半衰期短，难以特异性渗透到目标区域组织成像即被肾脏所代谢，且此类技术复杂，磁共振场强要求高，目前应用较少；（2）超顺磁性氧化铁(superparamagneticiron oxide nanoparticle，SPIO)对比剂法：利用 SPIO 能增强质子弛豫的特性，即使在较弱的磁场中也可产生较大的磁性，而外磁场撤消后磁性也迅速消失，即具有所谓超顺磁性，分布于组织后，呈不均匀分布，造成局部磁场的不均匀，从而加速了质子去相位的 T2 弛豫，使组织信号降低，可在体外用超顺磁性氧化铁颗粒标记骨髓间充质干细胞，用 MRI 可在活体上示踪移植到宿主体内的磁化标记干细胞。SPIO 在自旋回波中无论是顺磁性还是弛豫率均比 Gd3+要高，用临床 1.5TMR 成像即可显示被标记的细胞分布[23]。同时 SPIO 具有生物安全性好，标记效率高的优点。近年来已成功应用于心、脑、肾等器官方面的多种动物模型干细胞探索性治疗。但是目前有关磁共振示踪技术在组织工程软骨领域的应用研究鲜有报道。根据组织学知识，我们认为 SPIO 标记种子细胞修复关节软骨缺损更利于 MR 活体监测的应用。因为相对于其他组织，无血供的软骨组织可能会使纳米磁颗粒在组织内滞留时间更长；而且正常软骨内胶原纤维与蛋白多糖相互交错所形成的特有结构限制了细胞的流动，也会延长 SPIO 标记的软骨种子细胞的滞留时间。作为关节软骨组织工程种子细胞的 MRI 示踪剂，磁标记探针在细胞内滞留的适宜时间应为 6-12 月左右，以使移植细胞成像示踪时间与软骨缺损修复愈合时间接近。研究表明，富有亲水性质及带正电荷表面的包埋剂可使细胞主动摄取 SPIO；SPIO 粒径大小与其体内降解并排出体外的时间无相关性，而与其包埋剂分子量的大小及其表面得亲/疏水性质有关。目前市面上所用的葡聚糖包覆的 SPIO 示踪剂，其标记细胞的体内示踪时间仅 3 个月，若通过改变包埋剂分子量的大小、表面得疏水特性，可望延长标记细胞的示踪时间。

第二章 新型可控降解性超顺磁性纳米颗粒的研制

磁共振成像示踪磁标记细胞技术为工程化组织工程软骨移植修复关节软骨缺损的在体无创监测与临床疗效评价提供一种安全、有效的新方法。磁标记探针是该技术的关键，作为关节软骨组织工程种子细胞的磁标记探针应具备以下特点：①在细胞内的滞留时间应足够长（6-12 月），以使移植细胞成像示踪时间与软骨缺损修复愈合时间接近；②具有良好的超顺磁性和核磁应用特征，以使标记细胞利于被 MRI 示踪；③容易被细胞摄取而不影响正常细胞功能。针对这些特点，本课题组与四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心合作，采用乳液挥发法对晶体 Fe3O4核心使用 PEI 进行表面修饰，制备出新型可控降解性的 PEI/SPIO，并对其理化特性进行检测，为该技术的进一步应用奠定了物质基础。分子影像学技术中的磁标记细胞磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技术可为工程化组织工程软骨移植修复关节软骨缺损的在体无创监测与临床疗效评价提供一种安全、有效的新方法。根据 MR 对比剂的不同磁标记细胞 MR 示踪方法分为两类：（1）顺磁性 Gd3+对比剂法[22]：MR 成像时主要产生 T1 正性对比效应，因 Gd3+在血循环半衰期短，不能特异性渗透到各个组织成像就被肾代谢，且该类技术复杂,MR场强要求高，因此目前应用少；（2）超顺磁性颗粒对比剂法：利用 SPIO 能增强质子弛豫的特性，即使在较弱的磁场中也可产生较大的磁性，而外磁场撤消后磁性也迅速消失，即具有所谓超顺磁性，分布于组织后，呈不均匀分布，造成局部磁场的不均匀，从而加速了质子去相位的 T2 弛豫，使组织信号降低，可在体外用 SPIO 标记 BMSCs，利用 MRI 在体示踪移植至宿主体内的 BMSCs。SPIO 在自旋回波中无论是顺磁性还是弛豫率均比 Gd3+要高，在常规 1.5TMR 成像就能显示被标记的干细胞[23]。同时 SPIO具有生物安全性好，标记效率高的优点。近年来已成功应用于心、脑、肾等器官方面的多种动物模型干细胞探索性治疗[26-27].。然而有关磁标记技术在软骨组织工程种子细胞的在体示踪研究鲜有报道。

第三章 新型 SPIO 磁标记关节软骨组织.........21

3.1 材料与方法.........21

3.2 结 果 ......27

3.3 讨 论 ......34

3.4 小 结 ......35

第四章 SPIO 标记的 BMSCS 修复猪膝关节......36

4.1 材料和方法.........36

4.2 结 果 ......40

4.3 讨 论 ......44

4.4 小 结 ......45

结论

MRI示踪SPIO标记细胞与其它示踪方法相比具有显著的优越性，表现在：1.不影响种子细胞生物学特性；2.标记强度高；3.标记时间长，能满足软骨缺损修复期的示踪；4.非侵袭、无创、活体内直接动态示踪，适用于临床。但它也存在一些亟待解决的问题:1.干细胞增殖将稀释铁导致磁标记强度降低，使MR的敏感性降低；2. 周围未标记的细胞吞噬死亡的标记细胞释放出的铁而产生假阳性；3.磁标记bMSCs可被活体组织内的巨噬细胞和单核细胞吞噬而产生假阳性；4.移植入组织内的标记干细胞产生的低信号与多种病理因素所致信号丢失产生的低信号难以区分。上述问题可能影响磁共振示踪移植干细胞在活体内存活、分化情况等，因此，在干细胞移植过程中若能联合其他几种示踪方法，可以提高示踪效果。本实验证实通过分子克隆方法构建的GFP慢病毒载体和SPIO可以有效地标记体外分离培养的BMSCs。双标记骨髓间充质干细胞的增殖、分化活力与未标记骨髓间充质干细胞相比无改变。可以为进一步利用MRI在体示踪SPIO标记骨髓间充质干细胞在宿主体内的迁移，同时利用荧光显微镜从组织切片上观察到GFP标记骨髓间充质干细胞在宿主体内分布与转归分化奠定了必要的实验基础，以建立一种新的细胞标记技术平台，为运用骨髓间充质干细胞移植治疗软骨缺损的研究提供了新方法。

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