前言

骨肉瘤是世界上最常见的小儿恶性骨肿瘤，在所有儿童恶性肿瘤患者中占2.4 %⑴。50年前，手术是唯一可供选择的治疗方法，并且晚期骨肉瘤单纯手术治疗的预后很差，5年生存率低于20%[2]。随着化疗和骨科手术技术的进步，在20世纪80年代-90年代的治疗得到改善，现在骨肉瘤患者的长期生存率接近70%[3’4]。然而，尽管抗癌疗法在进步，生存率此后趋于稳定[5]。骨肉瘤的标准化疗是基于不同药物的组合：新辅助化疗是手术前给予氨甲噪呤、顺怕、阿霉素和手术后的化疗（氧甲碟呤，顺销，阿霉素，环磷酰胺，长春新碱）。尽管这样，仍然有约30%的骨肉瘤患者复发或发生转移[6]。由固有的或后天获得的化疗耐药导致的化疗低反应性是骨肉瘤患者低生存率和疾病复发的主要原因药物的摄取和转运障碍、药物的活化障碍、DNA损伤修复能力增强、细胞周期阻滞与调亡失衡和调亡通路障碍等都将会影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。肿瘤细胞耐药类型较多,可分为内在耐药和获得性耐药两类。前者是肿瘤细胞在治疗的初始阶段对多种抗肿瘤药物无明显反应;后者在化疗初期效果较好，但经过若干疗程后，肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生了耐药性。此外，根据耐药谱的不同，可分为原药耐药(PDR)和多药耐药（MDR)。PDR只能诱发对原药耐药而对其他药物不产生交叉耐药；MDR由一种药物诱发,对该药耐药的同时对其他结构及功能无关的化疗药物亦产生交叉耐药。然而对化疗药物的多药耐药（MDR)严重影响了其临床疗效和长期生存率。有数据显示复发患者生存率不足30%。由固有的或后天获得的化疗耐药导致的化疗低反应性是OS患者低生存率和疾病复发的主要原因[2]。然而，OS化疗耐药根本机制仍然知之甚少，且骨肉瘤多见于10-20岁的青少年，故对骨肉瘤治疗的研究着重于年轻患者。然而，骨肉瘤化疗耐药产生的根本机制仍然知之甚少。因此，本实验主要釆取上述新辅助化疗对骨肉瘤产生的耐药进行研究，找出儿童和青少年骨肉瘤化疗耐药的因素和阐明相关机制，在新治疗策略的发展中是举足轻重的。

研究统计，平均每1000个碱基对中就存在1个SNP，因此一个人类个体的基因组中应至少存在300万个SNP，据推测全部人群的SNP总数可达几千万甚至更多。SNPs共有4种形式，包括一种转换（即一种卩密淀变为另一种啼淀或一种嘆呤变为另一种嘌呤，C—T或G—A)和三种颠换（即噪呤与嚼淀之间的转变，C—A或G—T，C—G或G—C及T—A或A—T)，转换与颠换之比约为2:1。SNP在基因组编码区及非编码区均有分布，位于编码区的SNP(coding SNP, cSNP)较少，但对于遗传性疾病的研究具有重要意义。cSNP又分为同义和非同义两种，前者指SNP所致编码序列的改变，并不影响其翻译蛋白质的氨基酸序列；后者指SNP造成碱基序列的改变，可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能，如引起酶动力学参数、基因转录调控蛋白的DNA结合能力、跨膜受体信号转导活动及结构蛋白结构的改变等。而位于非编码区的SNP (如位于基因调控序列中的SNP)有可能影响基因表达量的多少。因此，这两类具有功能的SNP (非同义cSNP和可能改变基因表达量的SNP)具有显著的生物学意义，被称为功能多态性。功能性SNP可造成患者对某类疾病（如肿瘤）更加易感或对某类治疗方案更加敏感，从而使个体化医疗成为可能。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是广泛分布于人类基因组中的稳定的多态性位点，能够较好的反映个体遗传背景、鉴别患者之间的个体差异，并可实现快速化、自动化、规模化检测，在肿瘤的预后评估方面具有广阔的应用前景。

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第一章儿童青少年骨肉瘤化疗耐药相关影响因素的流行病学分析

1.材料和方法

从2011年1月至2013年9月，我们收集了 350对中国汉族儿童青少年OS患者，化疗后肿瘤坏死<90% (平均72.6%±15.9%)，被定义为低反应[34]。另一组350名年龄，性别，肿瘤的位置和发展阶段相匹配的中国汉族儿童青少年OS患者，化疗后肿瘤坏死》90% (平均95.2%±3.6%)，被定义为的良好反应[34]，作为对照组。这项研究，中南大学湘雅二医院伦理委员会批准。釆集血样前，获得参与者父母或未成年人的监护人的书面知情同意。

病例组纳入标准：

1)中国汉族儿童青少年OS患者（OS的诊断都是以病理活检为依据）

2)年龄在5-16岁

3)化疗后肿瘤坏死<90% (平均72.6%±15.9%)，被定义为低反应（对治疗的反应是由新辅助化疗后组织学上坏死的百分比确定）

4)患者均接受术前新辅助化疗如下：阿霉素静脉注射（3个疗程，25-30mg/mVday，3天/疗程），甲氨蝶呤（4个疗程，14g/m2/day，1天/疗程）和顺销动脉注射（3个疗程，35 mg/may, 3天/疗程）。

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2.结果

通过对研究对象的临床基本特征的进行信息采集以及血样的检测，患者临床及流行病学资料分布如表1所示：研究中病例组350例（50%)，对照组350例(50%)，病例组与对照组都用均值±标准差表示，分别为9.8±4.6、9.6±4.5，年龄范围在5-16岁，其中5-10岁组245例（70%)，10-16岁组105例（30%)，差异均无统计学意义（P〉0.05);病例组男性217例（62%)，女性133例（38%)，对照组男性同样217例(62%)，女性133例(38%)，差异均无统计学意义(P=1.0);病例组BMI(kg/m2)为17.5±4.2，对照组18.1±4.5，差异均无统计学意义（P=0.08);病例组肿瘤位置在长管状骨273例（78%)，位于中轴骨77例（22%)，对照组肿瘤位置在长管状骨273例（78%)，位于中轴骨77例（22%)，差异均无统计学意义（P=1.0);病例组肿瘤处于IIA期、IIB期、III期分别为：83(23.7%)、125(35.7%)、142 (40.6%),对照组与病例组相同，差异均无统计学意义（P=1.0);病例组收缩压（mmHg)为107.8±14.7，对照组（mmHg)为105.9±16.3，差异均无统计学意义（P=0.11);病例组舒张压（mmHg)为73.3±5.5，对照组（mmHg)为72.6±6.2,差异均无统计学意义(P=0.12);病例组血装ET-1水平(pg/ml)为14.2±1.9,对照组为14.0±1.7，差异无统计学意义（P=0.16)。

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第二章ET-1SNP选择和基因分型及LD和单倍型分析....... 12

1.材料和方法 .......12

2.结果.......21

3.讨论....... 23

4. 结论....... 25

第三章ET-1TG、GT单倍型与青少年骨肉瘤化疗耐药....... 26

1.材料和方法....... 26

2. 结果....... 37

3. 讨论....... 41

4. 结论.......42

第三章ET-1TG、GT单倍型与青少年骨肉瘤化疗耐药的相关性研究

1.材料和方法

1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青霉素的混合液中30~60分钟。

4.剪切：用眼科剪把组织切成2-3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30?50倍的0.13 %胶原酶液、375 U / ml的DNA酶液、0.1 %透明质酸酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5.消化：置于37°C温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6.分离：在消化过程中见消化液发混独时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不绣钢蹄，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500-1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量RPMI 1640培养基（含10%小牛血清）。

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总结

骨肉瘤是世界上最常见的小儿恶性骨肿瘤，在所有儿童恶性肿瘤患者中占2.4 %。50年前，手术是唯一可供选择的治疗方法，并且晚期骨肉瘤单纯手术治疗的预后很差，5年生存率低于20 %。随着化疗和骨科手术技术的进步，在20世纪80年代-90年代的治疗得到改善，现在骨肉瘤患者的长期生存率接近70%。然而，尽管抗癌疗法在进步，生存率此后趋于稳定[5]。骨肉瘤的标准化疗是基于不同药物的组合：新辅助化疗是手术前给予氨甲噪呤、顺销、阿霉素和手术后的化疗（氨甲噪呤，顺钻，阿霉素，环磷酰胺，长春新碱)。尽管这样，仍然有约30%的骨肉瘤患者复发或发生转移。由固有的或后天获得的化疗耐药导致的化疗低反应性是骨肉瘤患者低生存率和疾病复发的主要原因。在本研究中，第一部分我们用350对年龄、性别、肿瘤位置和肿瘤分期相匹配的儿童及青少年骨肉瘤患者进行研究，发现在年龄、性别及肿瘤位置和肿瘤分期、体重指数（BMI)、收缩压、舒张压、血荥ET-1的水平均无显著差异（表1 )。第二部分从所有3个SNP的检测结果可以发现在对照组中的rs5370明显偏离了 Hardy-Weinberg平衡，因此把rs5370从后面的分析中剔除掉。在rsl800541上的G等位基因与新辅助化疗的弱反应或者化学耐药性的风险降低有显著相关性（PcO.Ol),而位于rs2070699上的G等位基因与耐药性风险增加有相关性的倾向并不明显。

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参考文献（略）