第一章  引  言

麦红吸浆虫年发生 1 代或多年完成1 代。3 龄老熟幼虫从麦穗弹落入土，在土中结圆茧越冬、越夏，且主要分布在 0~20 cm 土层中。麦红吸浆虫的发育起点温度为（9.8±1.1）℃。越冬幼虫在10 cm 土温 7℃时破茧活动，20~23℃羽化成虫，并且土温达 20℃时，小麦进入抽穗盛期，麦红吸浆虫也进入成虫盛发期（刘家仁，1964；霍春玲等，1996）。羽化当天，雌虫释放一种外激素，引诱雄虫前来交配（李建军等，1999）。交配后当日或翌日即行产卵，而温度低于 10℃后不产卵（Pivnick et al., 1993）。麦红吸浆虫的产卵具有严格的选择性，一般将卵产在刚抽穗到扬花前的麦穗颖间和小穗间（Barnes, 1956; Smith et al., 2001），而不产在扬花后的麦穗上。卵几乎可以产在小穗外部的任何部分，包括穗轴（Mukerji et al., 1988; Smith et al., 2001）。一处3~5 粒，卵期 3~5 d，平均每雌总产卵量为 60-80 粒（Pivnick et al.,1993）。雌虫不直接把卵产在植物的生殖器官上。幼虫在产卵后 4~7 d 孵化(Elliott et al., 2011)，此时小麦进入灌浆期，幼虫孵化后从内、外颖缝间侵入，贴附于子房或刚灌浆的麦粒上吸食浆液，15~20  d 后，至小麦乳熟时幼虫也老熟，老熟幼虫躲在麦壳内，麦收前遇到下雨就从麦壳内爬到颖壳外或麦芒上，随雨滴、雨水、露水或自动弹落到土表，钻入土中 10~20  cm 处结圆茧越夏、越冬(胡木林等，1995)。温度上升 30℃以上时，麦红吸浆虫幼虫又恢复休眠（刘家仁，1964）。该幼虫可以在土中休眠将近10 个月，条件不适合，可通过调节体内某些酶类或者甘油的含量来达到滞育的目的（仵均祥等，2004；成卫宁等，2008）。

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第二章  麦红吸浆虫 EST-SSR分子标记的筛选

2.1  材料与方法

Taq DNA  聚合酶（500 u）和 dNTPs（2.5 mmol/L）均购自宝生物工程大连有限公司（Takara）；分子量标准（50 bp DNA Ladder（由 500 bp、400 bp、300 bp、250 bp、200 bp、150 bp、100 bp和 50 bp 构成），天根生化科技（北京）有限公司），分子量标准（DL2000 DNA Marker（由 2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp 和 100 bp 构成），天根生化科技（北京）有限公司）；丙烯酰胺溶液（29：1）、EDTA、TE（Tris-EDTA）、SDS（Sodium Dedecyl Sulfate，十二烷基硫酸钠）、硼酸、Tris  碱、EB（溴化乙锭）等购于生工生物工程（上海）有限公司；Agarose 琼脂糖（西班牙产）；TEMED（德国  Sigma  公司）；其他试剂为国产分析纯。5×TBE buffer 的配制：称取 Tris base 27.0 g，Boric Acid 13.75 g，溶于 400 mL 去离子 ddH2O，加入 0.5 M EDTA（pH 8.0）10 mL，搅拌溶解，最后加去离子水定容至 500 mL，4℃保存备用。 1×TBE 缓冲溶液：取 200 mL 5×TBE buffer，用去离子水稀释至总体积 1000 mL，常温保存备用。 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶：在 30  mL  ddH2O 中依次加入丙烯酰胺溶液（29：1）10  mL，5×TBE 10 mL，10%过硫酸铵  250 μL和TEMED 25 μL，用 50 mL  容积的注射器进行灌胶，插好梳子后，静置 1 h 以上方可上样。 银染溶液配制 1）固定液：40 ml 95%  乙醇+20 ml%  冰乙酸+340 ml 去离子水； 2）染色液：1.0 g AgNO3+500 ml 去离子水； 3）显色液：7.5 g NaOH+5 ml 甲醛+500 ml 去离子水； 4）终止液：3.75 g Na2CO3+500 ml 去离子水。

2.2  试验方法

利用 Primer Premier 5.0 软件（Lalitha，2000）对含有 SSR 位点的 EST 序列进行引物设计。引物设计原则为：EST 序列长度大于 100 bp；SSR 序列的开始和结束位置分别距 5′和 3′端不少于20  bp；引物长度 18~22  bp；理论退火温度 Tm 值为 40.5~65.5℃，而且上游和下游引物的 Tm 值相差不大于 5℃；GC 含量 40%~60%；PCR 扩增产物长度 100~400 bp；同时尽量避免引物二级结构（Dimer、Hairpin、False primer）以及连续 6 个碱基配对的出现。然后结合引物序列的组成特点，微卫星位点的重复基元情况和产物大小等多种因素，最后从中选出 26 对得分较高的 SSR 引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 反应体系（10 μL）为：10×buffer（Mg2+ free）1 μL，25 mmol/L Mg2+ 0.8 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1 μL，上游引物（10 pmol/L）0.5 μL，下游引物（10 pmol/L）0.5 μL，ddH2O 5.6 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，模板 0.5 μL。PCR 反应在 SensoQuest LabCycler 2.2 型 PCR 仪上进行，反应程序为：94℃预变性 4 min；95℃变性 30 s；54~58℃复性 1 min，72℃延伸 1 min; 35个循环；最后 72℃  10 min 终止反应。      电泳检测：PCR 反应结束后，在 10 μL 反应产物中加入 2 μL 6×DNA 上样缓冲液后，取 5 μL先用 1.0%琼脂糖电泳进行初步检测，然后取 3 μL进行 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液用 1.0×TBE，电泳结束后用银染法检测，最后凝胶扫描成像，记录结果。

第三章   基于微卫星分子标记的麦红吸浆虫种群遗传多样性及遗传结构分析 ......... 29

3.1  材料与方法 .............................. 29

3.2  试验方法 ................................... 30

第四章   基于线粒体标记的麦红吸浆虫种群遗传多样性及遗传结构分析 ................. 55

4.1  材料与方法 ....................... 55

4.2  结果与分析 ....................................58

第五章   全文结论 ..........................92

5.1  研究结论 ........... 92

5.2  创新点 ....................... 93

5.3  问题与展望 ....................93

第四章  基于线粒体标记的麦红吸浆虫种群遗传多样性及 遗传结构分析

4.1  材料与方法

基于单倍型频率，利用 Arlequin  v3.5.1.2 软件计算麦红吸浆虫各地理种群间的遗传分化水平（FST），并进行显著性分析（P < 0.05）。利用 DnaSP v5 软件对麦红吸浆虫所有种群、东部 10 个种群（LY、JN、FN、XS、XT、TJ、BJ、NY、HX 和 LC）和西部 6 个种群（HuaX、ZZ、LF、LT、WW 和 YC）分别进行遗传分化的分析。利用 Arlequin  v3.5.1.2 软件对麦红吸浆虫不同地理种群的分化和种群结构的地理格局进行分子变异分析（AMOVA）。在进行 AMOVA分析时，参照第三章 3.3.5 中STRUCTURE 2.2 对麦红吸浆虫 16 个种群的划分结果，当 K = 2 时，麦红吸浆虫的 16 个种群被划分为两大类群；当 K = 5 时，麦红吸浆虫的 16 个种群被划分为5 个类群。 利用 Arlequin v3.5.1.2 软件，采用 Tajima's D（Tajima, 1989）和 Fu's FS（Fu, 1997）两种方法对麦红吸浆虫 16 个地理种群和东西部两大分支种群进行中性检验，重复 1000 次，显著性水平为P < 0.05。为进一步了解麦红吸浆虫种群是否经历过历史上的种群扩张，利用 DnaSP 5.0 对麦红吸浆虫群体进行错配分布检验。

4.2 结果与分析

利用 CytB基因片段的特异引物对麦红吸浆虫 16 个地理种群 340 个个体进行 PCR 扩增，均获得了特异性较好的 PCR 产物。经序列测定和分析，在所有样品中最终获得准确一致的长为 644 bp 的序列。利用 MEGA4.1 软件对这些序列进行分析，结果表明，这些序列中碱基 T 的含量为43.0%，C 的含量为 12.0%，A 的含量为 36.4%，G 的含量为 8.6%，A+T（79.4%）的含量明显高于 G+C（20.6%）。在这些序列中共检测到保守位点（C）623 个，多态性位点（V）21 个，占碱基总数的 1.55%，其中包括简约信息位点（Pi）10 个（47.62%），自裔位点（Si）11 个（52.38%）。在碱基的替换中，共有 16 个位点发生了转换，3 个位点发生了颠换，另外有2 个位点既发生了转换也发生了颠换。所有多态性位点全部由碱基的替换产生，未发现插入和缺失。

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第五章  全文结论

5.1  研究结论

综上所述，本研究结果表明，我国的麦红吸浆虫不同地理种群间存在一定程度的遗传分化和比较清晰的遗传结构，局部地理种群间存在一定程度的基因交流。这些情况的出现不仅与自然选择、基因突变和遗传漂变等因素有关，同时与麦红吸浆虫各地理种群所处的生态地理环境、地理屏障、全球气候变化和自身的扩散传播方式等有关。另外，本文推断我国华北地区一些新发生区（如河北的栾城和徐水、北京和天津等）的出现，是由于黄淮地区的麦红吸浆虫种群向北扩散传播的结果，而不是来自麦红吸浆虫的西部分支。而南方一些老发生区麦红吸浆虫的消失与近些年来农业种植结构改变和全球气候变化等因素有很大的关系。

5.2 创新点

本研究应用（微卫星和线粒体 DNA）两种分子标记方法，首次对分布在我国北方的 16 个地理种群的麦红吸浆虫样品进行遗传结构及遗传多样性的分析。结果证明这些地理种群具有较高的遗传多样性，不同地理种群间存在一定程度的遗传分化（尤其是东西部区域地理种群间的遗传分化程度更加明显）和比较清晰的遗传结构，局部地理种群间存在一定程度的基因交流；聚类分析结果显示这些地理种群间存在明显的地理分布格局。

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参考文献（略）