第1章 绪论

钾通道广泛存在于各类组织细胞膜中，主要作用是维持细胞膜静息电位。对于心血管系统中，钾通道掌握着调节细胞静息电位水平和动作电位时程，对于维持心血管正常生理作用占有重要地位。心血管系统存的十余种钾通道并且又分化多种亚型，钾通道在心血管疾病以及糖尿病领域共同发挥作用逐渐得到学者共识，许多药物地靶点都为ATP 敏感钾通道，所以钾通道一直作为心血管领域的研究热点。1983年，美国科学家Noma 利用生膜片技术对豚鼠心脏进行研究发现其心肌细胞膜上存在ATP 敏感的钾通道（ ATP-sensitive K+  channels ，KATPC），作用于心脏心肌细胞，调节能量代谢以及兴奋心肌细胞。KATPC主要分为两大类：KATPC(sarcolemmal KATPchannel,sKATPC)，位于细胞膜中；mitoKATPC（mitochondrial KATPchan-nel)位于细胞线粒体膜中。尼可地尔作为一种 mitoKATPC 可能主要具有以下生理功能：1.对于维持线粒体内钾平衡，从而对线粒体容积起到调节作用，最终保护细胞；2.线粒体在氧化磷酸化过程中，质子泵转运 H+将会引起电荷变化，而mitoKATPC 对钾离子的摄取可部分弥补通道中H+的变化，进而稳定跨膜电位。心肌损伤中心室重塑主要变现在左心室的扩大、室壁的薄弱、舒缩功能降低等主要方面。是一个复杂的病理生理过程。久之演变为慢性的心力衰竭，在此过程中细胞凋亡参与心肌损伤后的心室重构成为研究的热点，并为临床改善心肌梗死后治疗预后提供新的治疗思路。

线粒体被认为是细胞凋亡的中央监管机构，对于心力衰竭以及心肌重构起到致关重要作用。目前已经公认 Bcl-2/Bax 比值决定细胞凋亡的命运。许多研究表面心肌线粒体以下功能对于对心肌细胞存活有至关作用：1.ATP 的合成；2.维持细胞内Ca2平衡。ATP 是电子传递链的主要产物，尼可地尔激活线粒体 ATP 敏感性钾离子通道，通过以下作用抑制心肌细胞凋亡 1.改善细胞线粒体功能；2.抑制线粒体内钙超载；3.保护线粒体完整性。 在心肌急性损伤时的氧化应激可影响线粒体内生成大量的活性氧自由基，过氧化氢，超氧化物，羟自由基等物质，是诱导心肌细胞死亡的重要因素之一。不同的ROS 有着不同的信号转导通路激活细胞凋亡的程序。研究表明，线粒体产生的活性氧自由基（mROS),经过PKD介导的线粒体-细胞核信号途径进行消除掉，保护心肌细胞免于 ROS 的氧化应激损伤。mROS 的积累导致PKD1 活化，PKD 的活性经两条途径：一条途径是 PKD PH 结构域中受酪氨酸激酶 Ab1 调控的 Tyr463 磷酸化；另外一途径是 PKCδ 介导的 Ser738 和 Ser742 磷酸化。活化后的 PKD 激活细胞核 NF-?B 转录因子，上调核内 SOD2 基因表达，MnSOD2 蛋白量增多，从而降解体内的 ROS，达到抗氧化应激损伤目的。MnSOD2 中的硝基酪氨酸促使酪氨酸激酶的活性减低，有作用的氧化能够阻止酪氨酸形成硝基酪氨酸。

第2章综述

急性心肌梗死（AMI）是心血管内科的常见疾病以及危重疾病，其发病原因为冠状动脉粥样硬化基础上，粥样硬化斑块出现破裂、溃疡、出血，致斑块脱落，并随血流致远端，造成远端血管阻塞引起心肌细胞缺血、缺氧使心肌细胞坏死。其近期及远期预后较差，可造成心脏室壁瘤、心律失常，附壁血栓，心室壁瘤，心包炎，心源性休克，栓塞、心腔增大，急性或慢性充血衰竭。心肌梗死部位斑痕形成、非梗死部位残存的心肌细胞肥大以及心肌间质纤维化等原因，造成心重重构，最终发展为慢性心力衰竭。其中机械因素、化学因素、神经内分泌因素是发生是引起左室结构、功能变化的主要原因。左室重构是通过心肌力学、神经激素和基因诱导的左室大小，形态和功能逐渐变化的过程。而蛋白酶系统激活，心肌细胞肥大，间质纤维化及细胞凋亡等因素是目前学者研究的重点。在心肌缺血性损伤导致心肌细胞死亡，可能显示出细胞凋亡，坏死或者两者的特征。鉴于这两种形式细胞死亡之间的显著差异，人们逐渐意识到，缺血性损伤的临床后果可与细胞损伤的具休形式有所不同。

尼可地尔是一种含有硝酸基的化合物并以烟酰胺为基本骨架，其独特的生物学作用基于其此种独特的化学结构。类似于硝酸酯类药物，其具有硝酸基使其同样具有硝酸酯类药物相似作用，可以直接或借助一氧化氮依赖方式促使鸟苷酸环化酶活化，环磷酸鸟苷（cGMP）增加，使钙离子泵活性增加，促使钙离子外流，同时使收缩蛋白对钙离子敏感性降低，使得血管平滑肌舒张，冠脉血管扩张、缓解冠脉血管痉挛、降低心脏耗氧量，减轻心脏负荷，缓解心绞痛，以上作用机制使其成为临床上缓解心绞痛药物的补充且不良反应较少。此外尼可地尔重要的烟酰胺结构可与血管平滑肌钾离子通道受体结合，促使钾离子外流，细胞膜超极化，致使电压依赖钙通道关闭，减少钙离子内流，加强舒张血管作用，有效改善心肌缺血，发挥其抗心绞痛药物作用。目前研究显示出其具有心肌细胞保护的潜在作用，通过激活线粒体ATP 敏感钾通道，发挥其缺血预后处理的作用。另一方面，实验研究己经表明，尼可尔作为一氧化氮（NO)供体在保护心脏免受缺血再灌注损伤发挥作用，NO 也再发挥其缺血预适应的作用。在尼可地尔影响心绞痛的研究中(The impact of Nicorandil in Angina,IONA)证明用尼可地尔治疗的稳定型心绞痛的个体，冠脉事件的明显减少，其预后的显著改善。Akao 等人证明，在心肌细胞中 mito KATP 通过二氮嗪抑制由于氧化应激诱导的细胞凋亡的药理活动。一些研究也证明尼可地尔通过激活线粒体 ATP 敏感的钾通道发挥抗细胞凋亡的作用。

3.1   取材.........................10

3.2   血清酶学测定 ..........11

3.3   HE 染色 .................11

第４章免疫组织化学技术ＭASSON 染色技术.............13

4.1   取材 ..............13

4.2   免疫组织化学染色 .......13

4.3   MASSON 染色.........15

第5 章   结    果..........16

5.1   三组大鼠造模结果 ...........16

5.1.1   统计 ISO 组及 Nic 组大鼠生存率及描记生存曲线............16

第6章讨论

心肌急性缺血缺氧常可导致心肌细胞急性损伤，且最早出现的是生理变化，心肌细胞发生有氧代谢障碍，从而引起心肌细胞坏死，纤维组织增生，间质纤维化，这一病理改变是参与心肌肥厚及心肌重塑的主要过程。由于心肌急性缺血缺氧发生氧化应激，心肌细胞线粒体可产生大量活性氧自由基（ROS),比如 H2O2 、超氧化物、羟自由基，其与缺血-再灌注损伤，心肌肥大，心力衰竭或其它心血管疾病密切相关。其中过氧化氢不单纯是 ROS 的其中一种，而且是研究 ROS 的工具，它可以快速的穿透细胞膜，生成羟自由基，羟自由基有可以激发链式级联反应生成更多的 ROS。因此，实验以线粒体钾离子通道开放剂尼可地尔作为阳性对照药，对于如何减轻心肌细胞在氧化应激中的损害成为当前研究热点。我们已经证明在大鼠心肌细胞中，尼可地尔可抑制氧化应激导致的细胞凋亡，故此本次实验应用 KATP通道关闭剂5-HD，结果显示，超声结果提示：ISO组、Nic组、5-HD 组相比具有明显差异，差异具有统计学意义（p＜0.05）；免疫组织化学的 5-HD 组心肌组织细胞排列紊乱，细胞胞浆内可见大量棕黄色颗粒。尼可地尔组较5-HD 组则明显减轻。进一步提示尼克地尔的作用途径与线粒体KATp 通道有关。证明在5-HD 存在时，线粒体的KATP通道通道关闭，尼可地尔的细胞保护作用消失，证实线粒体KATP 通道开放可以起到抗心肌损伤的作用。

通过上述实验可以明确尼可地尔在心肌急性损伤后发挥显著的心肌保护作用，为尼可地尔治疗心肌急性损伤，抑制心肌重塑提供新的理论依据。但是对于尼可地尔改善心肌损伤的具体作用机制还有待进一步研究。

第7章结论

1.大鼠心肌急性损伤后注射 ATP 敏感性钾离子通道开放剂尼可地尔可起到心肌保护作用，减少氧自由基形成，降低细胞内的钙超载。减轻心肌缺血缺氧后氧化应激对心肌造成的损伤.

2．5-HD对ATP 钾通道有阻断作用。进一步表明尼可地尔能够减少心肌细胞内 ROS 的生成，使缺氧受损心肌得到保护。

参考文献（略）