单体C反应蛋白调节破骨细胞分化的在职硕士论文机制研究

来源: www.sblunwen.com 作者:lgg 发布时间:2018-08-23 论文字数:38142字
论文编号: sb2018081718421322558 论文语言:中文 论文类型:硕士毕业论文
本文是一篇在职硕士论文,在职研究生则是国家计划内,以在职人员的身份参加全国研究生入学考试,录取后全脱产或半脱产在校学习的研究生学历教育的一种类型。
本文是一篇在职硕士论文,在职研究生则是国家计划内,以在职人员的身份参加全国研究生入学考试,录取后全脱产或半脱产在校学习的研究生学历教育的一种类型。毕业后可获得研究生学历。(以上内容来自百度百科)今天为大家推荐一篇在职硕士论文,供大家参考。
 
第一章 前 言
 
1.1 破骨细胞生理功能概述
生物体中骨骼为刚性的动态器官,骨组织始终处于不断被塑造和修复的动态过程中,为生物体的生理需求提供合适的强度支撑,因此骨骼系统在维持结构和功能的稳态过程中具有高度复杂性。近年来研究表明完整的骨骼系统主要包括两种组织为骨组织与软骨组织,三种骨相关细胞为成骨细胞(Osteocyte)、破骨细胞(Osteoclast)与软骨细胞(Chondrocyte)[1]。骨重塑(Bone remodeling)是调节骨骼结构与功能的主要代谢过程,在完整的重塑过程中主要显示为破骨细胞持续分解并吸收旧的骨基质和成骨细胞持续合成并建立新的骨基质,如此新旧骨基质交替形成一个稳定的骨组织平衡状态,使骨组织的重量与强度与生理环境状态相适应。在此过程中,主要参与者为破骨细胞[2,3]。在生物体的某些病理状态下,内分泌的紊乱或者细菌的侵入导致的炎症反应,都可以直接或间接导致骨重塑过程中的不平衡状态,造成破骨细胞的过度活化和骨吸收的增加,导致骨骼结构和功能的严重干扰,并可能导致各种病理性骨质破坏[4],这些骨性疾病主要包括骨质疏松症,牙周病,类风湿性关节炎,多发性骨髓瘤和转移性癌症。破骨细胞是由骨表面处或附近的单核细胞/巨噬细胞前体细胞分化产生的组织特异性多核巨细胞(图 1-1)。Takahashi[5]使用小鼠骨髓或脾细胞与基质细胞进行共培养,发现该培养系统可产生破骨细胞。该实验结果证明破骨细胞的形成必须保持基质细胞与骨髓细胞之间的紧密接触,并且表明基质细胞的衍生因子可以刺激破骨细胞的成熟。通过实验验证得到两种能够促进破骨细胞生成的衍生因子,分别为核因子 κB 受体活化因子的配体(ReceptorActivator of Nuclear kappaB Ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage Colony StlimulatingFactor,M-CSF)[6-9],缺少其中任意一种因子均无法形成成熟的破骨细胞[10-11]。
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1.2 破骨细胞重要信号通路
RANKL/RANK/OPG 信号通路系统作为破骨细胞分化过程中的关键信号传导通路,主要包括 RANKL,RANK 和 OPG。RANK 作为 RANKL 的受体位于破骨细胞的细胞膜上,OPG 作为 RANKL 的假性诱导受体发挥作用。成骨细胞及骨髓基质细胞可以分泌表达 OPG 和 RANKL,破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的 RANK 受体可识别并结合 RANKL,促进破骨细胞的分化和激活,并抑制破骨细胞的凋亡。而 OPG 可以与 RANKL 进行竞争性结合,来影响骨代谢。RANKL/ RANK/OPG 系统将骨代谢、免疫系统与内分泌系统联系起来,为骨性疾病的治疗提供新的思路。骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)作为骨保护剂是该系统中第一个被发现的分子,于 1997 年由两个独立的工作小组同时发现,发现 OPG 在体外和体内均具有抑制破骨细胞发育的能力[57,58]。OPG 也被称为破骨细胞生成抑制因子(OCIF,TNFRSF11B,TR1 或 FDRC1)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员,具有 N 端富含半胱氨酸区域,但与该家族的其他成员不同,OPG 缺乏跨膜结构域,表明 OPG 作为一种分泌型糖蛋白具有可溶性。在序列水平上,人和小鼠 OPG 同源性具有 85%,表明 OPG 在进化水平中高度保守。OPG 共由 401个氨基酸组成,N 端的 21 个氨基酸为信号肽序列,前体蛋白质通过糖基化后切割信号肽而加工成其成熟形式的 OPG。成熟的 OPG 具有 380 个氨基酸,先在胞内形成约55kDa的单体形式,通过两条肽链之间的Cys400形成二硫键,以110kDa的同源二聚体形式分泌到胞外。OPG 多肽链中 23 个 Cys 相互之间可形成 9 对二硫键,讲 OPG 分为 7 个结构域,形成 3 个功能区:第 1~4 结构域形成 TNF 受体结构区,是 OPG 的主要功能区,能够抑制破骨细胞的活化和功能;第 5~6 结构域形成死亡域同源区,能够与 Fas 蛋白跨膜区形成融合蛋白,引起细胞凋亡的发生。第 7 结构域为肝素结合结构区。OPG 在体内多种组织中均有存在,包括脑、肝、肺、心、肾、骨骼肌、皮肤、肠、颅骨、胃、睾丸和胎盘中[57-61]。机体内许多细胞因子与激素都可以对 OPG 的表达进行调节,促进 OPG mRNA 表达的因子主要有 1,25(OH)2D3、雌激素、BMP、IL-1、TGF 和 TNF[62-67],而主要起抑制作用的为 PTH、糖皮质激素、PGE2、IGF-I[68-72]。这些调控因子主要通过 cAMP信号通路传导、活化 OPG 启动子、缩短 mRNA 半衰期对 OPG 进行表达调控。
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第二章 材料和方法
 
2.1 实验材料
2.1.1 实验细胞
RAW264.7 细胞为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞,购自于美国 ATCC 细胞库,使用 DMEM 培养基;BMDM 为骨髓来源的巨噬细胞,分离于 C57BL/6小鼠股骨及胫骨骨髓细胞,使用α-MEM 培养基;PMBC 为外周血来源的单核细胞,分离于 C57BL/6小鼠的外周血,使用 RPMI-1640 培养基。所有培养基中均加入10%FBS。
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2.2 蛋白相关实验方法
 
2.2.1 CRP 蛋白的纯化
由于直接购买的 CRP 蛋白中含有极少量不同构型的蛋白和内毒素的污染残留,会直接影响蛋白的生理特性,因此为明确实验中CRP处理的真实影响,需要保证CRP 五聚体的完整状态和纯度。实验中通常将 CRP 采用 PC 纯化方法将非五聚体蛋白除去,再通过过柱方法除去蛋白中残留的内毒素,最后洗脱下来的则为具有高纯度的 CRP 五聚体蛋白。
 
2.2.1.1 PC 柱材纯化五聚体 CRPa.
将超声处理过后的筛板加入至针筒注射器中,缓慢加入 PC 柱材后待其自然沉降至柱体积约 1.7-1.8 mL,再次加入筛板保证柱材的稳定性;b.加入 5 mL binding buffer 平衡 2 个柱体积后加入 1 mL CRP,待蛋白溶液的上液面进入 PC 柱材中,盖上纯化柱盖子,放置 4 度孵育 1h;c.加入 10 mL binding buffer 清洗 5 个柱体积后,加入 elution buffer 进行洗脱,待溶液上液面进入柱材后,前面洗脱流出的 700μL 放弃,随后以 500 μL 体积开始收集洗脱样品,共收集 10 管;d.为避免 PC 洗脱不彻底,加入 EDTA 洗脱溶液清洗柱材,保持柱材上的CRP 被洗脱完全;e.尽快加入 5 mL storage buffer,保证柱材的湿润状态。f.以原蛋白浓度作为基准,合并含蛋白较多的洗脱液,保持蛋白浓度约为1-5 mg/ mL,使用 TBS+Ca2++NaN3 进行透析。
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第三章 mCRP 诱导破骨细胞分化.........45
3.1 研究背景........45
3.2 mCRP 的表达和纯化...........45
3.3 mCRP 但非 nCRP 诱导 Raw 26
4.7 细胞系的破骨细胞分化 ..............47
3.4 mCRP 但非 nCRP 诱导 BMDMs 和小鼠体内的破骨细胞分化 .........51
第四章 mCRP 不通过诱导 RANKL 来驱动破骨细胞分化.......56
4.1 研究背景........56
4.2 mCRP 作用差异基因筛选..............56
4.3 mCRP 作用与 RANKL 及 LPS 对比 ........59
4.4 抑制剂筛选 mCRP 与 RANKL 信号通路 ..........60
第五章 mCRP 抑制 RANKL 诱导的破骨细胞分化..........63
5.1 研究背景........63
5.2 体外细胞体系中 mCRP 中和 RANKL 的作用 .............63
5.3 CRP 敲除小鼠的验证及鉴定 .........65
5.4 CRP 敲除导致小鼠炎性骨损伤加重 ........67
 
第六章 CBS 介导 RANKL 的结合和抑制作用
 
6.1 研究背景
由于 mCRP 可抑制并中和 RANKL 的破骨细胞分化作用,我们需要确认mCRP 对 RANKL 的阻抑机制和途径。先前实验发现细胞膜内富含胆固醇的脂筏是介导 mCRP 对内皮细胞效应的主要受体,考虑胆固醇结合序列是否也在破骨细胞分化过程中发挥作用。五聚体 CRP 蛋白中 aa 35-47 肽段位于蛋白亚基的非极性中心,并且和亚基之间相连的序列重叠。当 CRP 解聚为 mCRP,aa 35-47 肽段会暴露出来,这一特征可增强 mCRP 在胆固醇单层膜的插膜能力[171],从而引发一系列的炎症反应。mCRP 可通过 CBS 与多种类型的分子发生物理互作[204],CBS 的功能和特异性决定于其 N 端的 Cys36、Leu37 和 His38,同时 CBS 的固有无序性决定该序列功能的多样性。BMDM 细胞中分别加入 mCRP(100μg/mL)与 RANKL(50ng/mL),分别处理 4h、12h、24h 后进行 qPCR 检测,确定破骨分化相关基因的表达。结果显示与对照组相比,mCRP 与 RANKL 共处理组可显著抑制 RANKL 的破骨分化活性作用,与 mCRP 表达水平相近,且整个抑制作用过程呈现时间依赖性和持续性。
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结论
 
1.CRP 诱导破骨细胞分化取决于单体构象;
2.微阵列分析和信号转导抑制剂筛选表明,mCRP 诱导破骨细胞分化不依赖于 RANKL;
3.mCRP 抑制 RANKL 对破骨细胞分化的活性;
4.mCRP 以高亲和力结合 RANKL。mCRP 和 RANKL 之间的物理相互作用由 CBS 介导。
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参考文献(略)

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